FrCas9核酸酶

FrCas9核酸酶產品簡介

FrCas9核酸酶是珠海舒桐醫療自主研發的一種切割效率高、脫靶效應低的新2型核酸酶產品,該成果“FrCas9 is a CRISPR/Cas9 system with high editing efficiency and fidelity”成功發表于Nature Communications。

通過已建立的流程化新型CRISPR篩選鑒定平臺，我司發現來自嚙齒糞桿菌Faecalibaculum rodentium的一種新型FrCas9核酸酶，是目前已知的切割效率最強、脫靶效應最低、特異性最好、PAM限制最少的CRISPR，顯著優于目前最常用的SpCas9。FrCas9屬于Type II-A型CRISPR，與SpCas9的同源性小于80%，體積為1372個氨基酸（圖1A、B）。

圖1

FrCas9的PAM為5′-NNTA-3′，SpCas9的PAM為5′-NGG-3′，我們直接在人基因組上選擇11個位點同步比較FrCas9與SpCas9及不同SpCas9高保真變體（SpCas9-HF1、HiFi-Cas9和eSpCas9）的切割效率及脫靶效應。在這里我們用到的方法為舒桐醫療科技自主研發的GUIDE-seq脫靶檢測技術。結果顯示，FrCas9的在靶reads數均高于SpCas9及其高保真變體，且FrCas9在多個位點均未檢測到脫靶，說明FrCas9具有較高的切割效率以及較低的脫靶效應(圖2C、D)，為安全高效的基因編輯臨床治療及基礎科研提供更多選擇。

圖2

我們發現FrCas9的PAM（NNTA）為回文序列（圖3E），即：同一個PAM區域，正鏈和負鏈各存在一個靶點。因此，我們進一步將FrCas9突變為nicking形式的切口酶（nFrCas9），發現E796A突變位點的nFrCas9編輯效率最高，其CBE及ABE的編輯窗口分別為6-10位堿基以及6-8位堿基，二者在ClinVar數據庫中的編輯范圍分別有90.38%和92.21%（圖3F）。與SpCas9對應堿基編輯器不同的是，FrCas9獨特的回文PAM可以同時編輯PAM上下游序列，進而拓寬FrCas9基因編輯器的范圍，因此FrCas9在單堿基編輯上具有極大的應用潛力。

圖3

另外，由于FrCas9的PAM為NNTA，與TATA box序列完美匹配，可直接靶向基因TATA區域，可應用于如下場景：1)基因敲除。通過切割TATA-box，FrCas9使ABCA1、UCP3和RANKL的表達分別降低了31.37%、49.91%和39.62%，達到基因敲除的目的；2)基因轉錄抑制。dFrCas9可通過抑制RNA聚合酶與TATA-box的結合進而抑制目標基因轉錄。通過結合TATA-Box,FrCas9使ABCA1、UCP3和RANKL的表達量分別降低了61.67%、45.61%和42.60%；3)基因轉錄激活。通過CRISPR激活實驗表明dFrCas9-VP64能夠有效地進行轉錄激活，且在ABCA1、GH1和MBL2中的激活效率高于dSpCas9-VP64（圖4G、H）。FrCas9為基礎科研提供了直接的基因調控工具。

圖4

FrCas9產品及應用

1. 提供GMP級別的FrCas9蛋白；
2. 與sgRNA在體外結合使用，進行體外切割，驗證sgRNA的活性及切割效率（見圖5A）;
3. 轉染到細胞中靶向切割進行基因編輯（見圖5B）;
4. 注射到胚胎或動物體中進行體內基因組編輯。

圖5

FrCas9產品優勢

1. 高純度高活性的Cas9蛋白，切割效率強、脫靶效應低、特異性好、PAM限制少；
2. 所純化的Cas9蛋白都進行了活性驗證，無核酸酶污染;
3. 提供工業級大包裝：可按要求進行不同規格定制

FrCas9產品規格

參考文獻

1. Cui Z, et al. FrCas9 is a CRISPR/Cas9 system with high editing efficiency and fidelity.?Nature Communications?13, 1-12 (2022)
2. Fan W, et al. Non-homologous dsODN increases the mutagenic effects of CRISPR-Cas9 to disrupt oncogene E7 in HPV positive cells.?Cancer Gene Ther, (2021)
3. Cui Z, et al. The comparison of ZFNs, TALENs, and SpCas9 by GUIDE-seq in HPV-targeted gene therapy.?Mol Ther Nucleic Acids?26, 1466-1478 (2021)