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| 實驗方法原理 |
這種蛋白質測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是應用最廣泛的一種方法，由于其試劑乙的配制較為困難（現在已可以訂購），近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即folin-酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。這兩種顯色反應產生深蘭色的原因是：在堿性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物。folin-酚試劑中的磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。 ? folin-酚試劑法最早由lowry確定了蛋白質濃度測定的基本步驟。以后在生物化學領域得到廣泛的應用。這個測定法的優點是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點是費時間較長，要精確控制操作時間，標準曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，干擾物質較多。對雙縮脲反應發生干擾的離子，同樣容易干擾lowry反應。而且對后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對顯色無影響，但這些物質濃度高時，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉-氫氧化鈉溶液，即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色后會色淺，則必須提高碳酸鈉-氫氧化鈉溶液的濃度1～2倍。 ? 進行測定時，加folin-酚試劑時要特別小心，因為該試劑僅在酸性pH條件下穩定，但上述還原反應只在pH=10的情況下發生，故當folin一酚試劑加到堿性的銅-蛋白質溶液中時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應即能發生。 此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。 ? 此法可檢測的最低蛋白質量達5 mg。通常測定范圍是20~250 mg。 |
|---|---|
| 實驗材料 | |
| 試劑、試劑盒 | |
| 儀器、耗材 | |
| 實驗步驟 |
一、試劑與器材 ? 1. ?試劑 ? （1）試劑甲 ? （a）10 g Na2CO3，2 g NaOH和0.25 g酒石酸鉀鈉 （KNaC4H4O6-4H2O）。溶解于500毫升蒸餾水中。 ? （b）0.5 g硫酸銅（CuSO4-5H2O）溶解于100毫升蒸餾水中，每次使用前，將50份（a）與1份（b）混合，即為試劑甲。 ? （2） 試劑乙：在2升磨口回流瓶中，加入100 g鎢酸鈉（Na2WO4-2H2O），25 g鉬酸鈉（Na2MOO4-2H2O）及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時，回流結束時，加入150 g硫酸鋰（Li2SO4），50毫升蒸餾水及數滴液體溴，開口繼續沸騰15分鐘，以便驅除過量的溴。冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復滴加液體溴的步驟）。稀釋至1升，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時用標準NaOH滴定，酚酞作指示劑，然后適當稀釋，約加水1倍，使最終的酸濃度為1 N左右。 ? （3） 標準蛋白質溶液：精確稱取結晶牛血清清蛋白或 G-球蛋白，溶于蒸餾水，濃度為250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁，可改用0.9% NaCl溶液。 ? 2. ? 器材 ? ?可見光分光光度計、旋渦混合器、 秒表、試管16支。 ? 二、操作方法 ? 1. ?標準曲線的測定 （1）取16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分成兩組，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升標準蛋白質溶液（濃度為250 mg/ml）。 （2）用水補足到1.0毫升，然后每支試管加入5毫升試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫（20～25℃）放置10分鐘。 （3）再逐管加入0.5毫升試劑乙（folin-酚試劑），同樣立即混勻。 （3）這一步混合速度要快，否則會使顯色程度減弱。然后在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照，于700 nm處測定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質的量為橫座標，吸光度值為縱座標，繪制出標準曲線。 ? 注意：因lowry反應的顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時間，即第1支試管加入5毫升試劑甲后，開始計時，1分鐘后，第2支試管加入5毫升試劑甲，2分鐘后加第3支試管，余此類推。全部試管加完試劑甲后若已超過10分鐘，則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙，1分鐘后第2支試管加入0.5毫升試劑乙，2分鐘后加第3支試管，余此類推。待最后一支試管加完試劑后，再放置30分鐘，然后開始測定光吸收。每分鐘測一個樣品。 ? 進行多試管操作時，為了防止出錯，每位學生都必須在實驗記錄本上預先畫好下面的表格。表中是每個試管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的順序，逐管加入。最下面兩排是計算出的每管中蛋白質的量（微克）和測得的吸光度值。 ? folin—酚試劑法實驗表  ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2. ?樣品的測定 取1毫升樣品溶液（其中約含蛋白質20~250微克），按上述方法進行操作，取1毫升蒸餾水代替樣品作為空白對照。通常樣品的測定也可與標準曲線的測定放在一起，同時進行。即在標準曲線測定的各試管后面，再增加3個試管。如上表中的8、9、10試管。 根據所測樣品的吸光度值，在標準曲線上查出相應的蛋白質量，從而計算出樣品溶液的蛋白質濃度。 ? 注意:由于各種蛋白質含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質而變化。因而本測定法通常只適用于測定蛋白質的相對濃度（相對于標準蛋白質）。 |
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