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一、 樣品RNA的抽提
? 1. ?取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。
? 2. ?兩相分離 每1 ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12 000 rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
? 3. ?RNA沉淀 將水相上層轉移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12 000 rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。
? 4. ?RNA清洗 移去上清液，每1 mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀?；靹蚝?，4℃下7 000 rpm離心5分鐘。
? 5. ?RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
? 6. ?溶解RNA沉淀 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水4 0ul用槍反復吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。
? 二、 RNA質量檢測
? 1. ?紫外吸收法測定
? 先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。
? ?（1）濃度測定
? A260下讀值為1表示40 ug RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為：A260 x 稀釋倍數 x 40 ug/ml。具體計算如下： ? RNA溶于40 ul DEPC水中，取5 ul，1:100稀釋至495 ul的TE中，測得A260 = 0.21 ? RNA 濃度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml 或 0.84 ug/ul ? 取5 ul用來測量以后，剩余樣品RNA為35 ul，剩余RNA總量為： ? 35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug ? （2）純度檢測
? RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。
? 2. ?變性瓊脂糖凝膠電泳測定
? （1）制膠
? 1 g瓊脂糖溶于72 ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10 x MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
10x MOPS電泳緩沖液 濃度 ?成分 0.4 M ?MOPS，pH 7.0 0.1 M ?乙酸鈉 0.01 M ?EDTA
? 灌制凝膠板，預留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內，加足量的1xMOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。 ? （2）準備RNA樣品
? 取3 ugRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10 ug/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。 ? （3）電泳
? 上樣前凝膠須預電泳5 min，隨后將樣品加入上樣孔。5-6 V/cm電壓下2 h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2-3 cm。
? （4）紫外透射光下觀察并拍照
? 28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現，即更高分子量的彌散遷移物質或者帶，RNA的降解表現為核糖體RNA帶的彌散。用數碼照相機拍下電泳結果。
? 三、樣品cDNA合成
? 1. ?反應體系
? 序號 ? ? ? ? ?反應物 ? ? ? ? ? 劑量 1 ? ? ? ? ?逆轉錄buffer ? ? ? 2 ul 2 ? ? ? ? 上游引物 ? ? ? ? ? ? ?0.2 ul 3 ? ? ? ? 下游引物 ? ? ? ? ? ? ?0.2 ul 4 ? ? ? ? ?dNTP ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.1 ul 5 ? ? ? 逆轉錄酶MMLV ? ? 0.5 ul 6 ? ? ? ? DEPC水 ? ? ? ? ? ? ?5?ul 7 ? ? ? ? ?RNA模版 ? ? ? ? ? ?2 ul 8 ? ? ? ? ? 總體積 ? ? ? ? ? ? ? 10 ul
? 輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心。
? 2. ?混合液在加入逆轉錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內外溫度一致，然后加逆轉錄酶0.5 ul，37℃水浴60分鐘。
? 3. ?取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。
? 四、 梯度稀釋的標準品及待測樣品的管家基因（β-actin）實時定量PCR
? 1. ?β-actin陽性模板的標準梯度制備 陽性模板的濃度為1011，反應前取3 μl按10倍稀釋（加水27 ul并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。
? 2. ?反應體系如下：
? 標準品反應體系
? 序號 ? ? ? ? ? 反應物 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 劑量 1 ? ? ? SYBR Green 1 染料 ? ? ? ? ? ? 10 ul 2 ? ? ? 陽性模板上游引物F ? ? ? ? ? ? ?0.5 ul 3 ? ? ?陽性模板下游引物R ? ? ? ? ? ? ?0.5 ul 4 ? ? ? ? ? ? ? ? dNTP ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?0.5 ul 5 ? ? ? ? ? ? ? ? Taq酶 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1?ul 6 ? ? ? ? ? 陽性模板DNA ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?5 ul 7 ? ? ? ? ? ? ?ddH2O ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?32.5 ul 8 ? ? ? ? ? ? ? 總體積 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?50 ul
? 輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心。
? 3. ?管家基因反應體系：
? 序號 ? ? ? ? ? ?反應物 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?劑量 1 ? ? ?SYBR Green 1 染料 ? ? ? ? ? ? ? ? ? 10 ul 2 ? ? ?內參照上游引物F ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.5 ul 3 ? ? 內參照下游引物R ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 0.5?ul 4 ? ? ? ? ? ? ? dNTP ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?0.5 ul 5 ? ? ? ? ? ? ? Taq酶 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1 ul 6 ? ? ?待測樣品cDNA ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 5 ul 7 ? ? ? ? ? ? ?ddH2O ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?32.5 ul 8 ? ? ? ? ? ? 總體積 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?50 ul
輕彈管底將溶液混合， 6000 rpm短暫離心。
? 3. ?制備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機，反應條件為：93℃ 2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個循環。
? 五、 制備用于繪制梯度稀釋標準曲線的DNA模板
? 1. ?針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應。
? 2. ?反應體系
? 序號 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 反應物 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?劑量 1 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 10× PCR緩沖液 ? ? ? ? ? ?2.5 ul 2 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? MgCl2 溶液 ? ? ? ? ? ? ?1.5 ul 3 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 上游引物F ? ? ? ? ? ? ? ? 0.5 ul 4 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 下游引物R ? ? ? ? ? ? ? ?0.5 ul 5 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?dNTP混合液 ? ? ? ? ? ?3 ul 6 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?Taq聚合酶 ? ? ? ? ? ? ? 1 ul 7 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? cDNA ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1 ul 8 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?加水至總體積為 ? ? ? ? ? ? ? 25 ul
? 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
? 35個PCR循環（94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘）； 72?C延伸5分鐘。
? （3）PCR產物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。
? （4）將PCR產物進行10倍梯度稀釋: 將PCR產物進行10倍梯度稀釋: 設定PCR產物濃度為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。
? 六、 待測樣品的待測基因實時定量PCR
1. ?所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應體系。 ? 2. ?體系配置如下：
? 序號 ? ? ? ? ? ? 反應物 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?劑量 1 ? ? ? ? ? ?SYBR Green 1 染料 ? ? ? ? ? ? ? 10 ul 2 ? ? ? ? ? ? ? ?上游引物 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1 ul 3 ? ? ? ? ? ? ? ?下游引物 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1 ul 4 ? ? ? ? ? ? ? ? ?dNTP ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 1 ul 5 ? ? ? ? ? ? ?Taq聚合酶 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2 ul 6 ? ? ? ? ? ? 待測樣品cDNA ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?5 ul 7 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ddH2O ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?30 ul 8 ? ? ? ? ? ? ? ? ? 總體積 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 50 ul
? 輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心。
? （3）將配制好的PCR反應溶液置于Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件為：93℃ 2分鐘預變性，然后按93℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做個循環，最后72℃7分鐘延伸。
? 七、 實時定量PCR使用引物列表
? 引物設計軟件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補；引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構；引物不在模板的非目的位點引發DNA 聚合反應(即錯配)。
? 八、電泳
? 各樣品的目的基因和管家基因分別進行Realtime PCR反應。PCR產物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，GoldView染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。 |
