造血細胞的慢病毒轉導

慢病毒載體轉染造血細胞

材料

試劑

抗 CD； M 抗體結合的磁珠（若轉導早期造血干細胞； Miltenyi Biotec In c .)

牛血清白蛋白（BSA; P B S 中 2% )

于 100 ml PBS 中溶解 2 g BSA (片段 V)。通 過 0. 2um 濾器過濾。 4°C 保存。

CaCl2 (2mol/L)

溶解 29.4 gCaCl2 (J.T.Baker) 于 70 ml 水中。補水至 100 ml。 0.2nm 濾器過濾。

細胞

293T (含 S V 4 0 大 T 抗原的人類胚腎細胞）

H T 1080 (人 成 纖 維 肉 瘤 細 胞 系）

被轉導的細胞（靶細胞）

甲 醛（3. 7% 在 P B S 中）

用 PBS 以 I : 1 0 比例稀釋 3 7 % 甲醛 溶 液（Sigma-Aldrich)。

2 X HEPES 緩 沖 液（ H BS; 0.05m ol/L HEPES、 0.28m ol/L NaCl, 以 及I .5 mm ol/L Na2 HPO4 , pH 7. 12)

于 200 ml 水中溶解 2. 38 g HEPES、 3. 28 g NaCl、 42. 6 mg Na2 HPO4。 0. 2umn 濾器過濾。

293T 和 H T 1 0 8 0 細 胞 培 養 基

含 10% 胎 牛 血 清（FBS) 的 高 糖（4500 mg/L) DMEM 培養基， 100ug/ml 青霉素， 100ug/ml鏈 霉 素

靶細胞培養基

根據細胞類型和實驗設計選擇合適的培養基，細胞因子和其他營養成分。如在此法中，所用 的 CD34+轉導培養基為： IMDM, 含 2 0 % BIT9500 (干細胞技術， Vancouver, B.C.Canada)、 100ng/ml 干 細 胞 因 子（SCF)、 100ng/mlFlt3-lig，以及 100ng/ml 促血小板生成素（TPO)。

磷酸鹽緩沖液（P B S ， p H 7. 4)

137 mm ol/L NaCl

2.7 mm ol/L KCl

8.lm m ol/L Na2 H P 0 4

I . 5 mmol/L KH2P 〇 4

質粒 DNA

此 法 的 質 粒 D N A , 即 含 目 的 轉 基 因 的 pHIV-GFP、 pCgp、 pCMV-reu、 pCMV-G。依據操作 說 明 用 QIAGEN質粒試劑盒純化所有的質粒DNA。

聚 凝 胺（4 mg/ml)

溶解 40 mg 聚 凝 胺（hexadimethrine bromide) 于 IOml水 中 。 0 .2um 濾器過濾。 4°C 保存。RetroNectin (Takara Mirus Bio Inc. > Madison, Wisconsin)

依據操作說明制備 25fig/ml RetroNectin。 4°C 保 存 。

TE 79/10

用水以 I : 10 比例稀釋 TE79 (lOmmol/L Tris-HCl 和 lm m ol/L EDTA, pH 7. 9 ) 。 0.2um濾器過濾。

儀器

離 心 管（1X3. 5in polyallomer [Beckman])

用 前 高 壓 滅 菌（15psi, 15?20 min)。

熒光激活細胞分離器（FACS)

孵 箱37℃

非組織培養處理平板（4 8 孔 和 2 4 孔）

培 養 板（12 孔）

注 射 器（30 ml)

針頭式過濾器（0. 2um)

細胞培養 M (IOmm)

超速離心機和 SW 28 轉 頭（Beckman)

方 法

慢病毒載體的生成：載體的包裝
I. 293T 細胞在完全培養基， 37°C 烘箱， 5 % C O 2 中生長。轉染 前 24 h ，將指數生長的293T 細胞以 4 X 10⁶ 個/平板的密度接種于 Io o m m 培養皿中。轉染時細胞密度約為 80% 。

2?每 IOOm m 平板細胞制備 I m l 磷酸轉-D N A 懸液，方法如下：

a?為每個轉染平板準備兩個無菌管，標記為管〗和管 2。

b?向管 1 中加人 0. 5m l 2 X H B S 。

c. 向管 2 中加入 TE 79/10。 TE 79/10 的體積等于 440W 減 去 DNA 溶液的體積。

d?向管 2 中加人 15/xg 含轉基因的轉移載體， 15ugpCgp、 5ugpCMV-rew 以及 5ug pCMV-G ，混勻。

e?向管 2 中加 60ul 2mol/LCaCl2，混勻。

f?將管 2 中的液體逐滴地加入管 1 中并輕微混勻。

g . 室溫孵育 30 min。

3?吸打或漩渦混合沉淀。

4 . 向含有細胞的 IOOm m 平板中加 I m l 懸液。緩慢滴加并輕柔晃動培養基。將平板放回3 7 °C 孵箱孵育 4 h 并棄去沉淀。

S?用 6m l 新鮮培養基替換舊培養基。加 60ul 0.6m o l / L 丁酸鈉。孵箱孵育。

6.48 h 后，收集上清，一 80°C 凍存，或進行濃縮步驟。

載體的濃縮

7.900 g 離 心 I O m in 上 清（新鮮收集或從冰箱中解凍）以去除細胞碎片。

8.0.2 um 針頭濾器過濾上清。

9 . 將上清轉移到高壓滅菌的離心管中 4°C， BeCkm anS W 28 轉頭， 24 500r/m in 下超速離心 I. 5 h 以濃縮上清液。

10? 棄去上清，將沉淀以適量的培養基重懸，例如，若 需 要 1 〇〇倍濃縮，則 對 應 30 ml原始溶液需加 300ul 培養基。

1 1 . 以 10?1 5 4 分裝濃縮后的載體，一 80°C保存。

載體的滴度測定

12?以 5X10⁴ 個/孔接種于 12 孔板，完全培養基， 37°C 孵箱， 5% C02 培養過夜。

13?向細胞中加人各個稀釋梯度的載體以及 4ul/m l 聚凝胺。繼續培養 48 h 。

14?消化細胞。離心，棄上清，用 300ul 含 3. 7 % 甲醛的 PB S 重懸細胞。

15.FA CS 分 析 E G F P 陽性細胞的百分率。

滴度以每毫升濃縮載體的轉染單位（TU) 表 示 ，即 TU/ml。

慢病毒載體轉染靶細胞

用于轉染培養的造血細胞

16?在 2 4 孔板中用 Im l 培養基以 2XIO⁵個細胞/孔接種指數生長的細胞。

17?根據細胞類型的不同加人不同體積的濃縮載體。對于 K 562 細 胞 系（C M L 白血病細胞系）來說，感 染 指 數（m oi ) 為 10 時可以達到 100% 的轉導率。

1 8 . 加 知 g /m l 聚凝胺。細胞于 37°C 孵育。

19?孵育過夜后，將細胞離心，棄上清并用新鮮培養基重懸，再培養。

2 0 . 轉 染 48 h 后 ，由 FA CS 分析計算轉染效率 （見疑難解答)。

轉染早斯造血干細胞

21?依操作流程，利 用 結 合 抗 CD34+抗體的免疫磁珠從臍帶血或骨髓中分離純化CD34+造血干細胞。

22.轉染前 48 h ，在 C D 34+轉染培養基中培養 C D 34+細胞。

2 3 . 用 0.2m l 25pg/ml RetroNectin (約 5/ug/cm2) 包被 48 孔培養板，室溫下 2 h。

2 4 . 棄 去 R etro N ectin , 然后添加 0? 2m l 含 2% B SA 的 PB S 封閉。室溫下 30 min。

25?用 PB S 清洗培養板后，用普通的 IM D M 培養基調整慢病毒載體至合適的感染指數(范 圍 5?4 0 )，終體積 200^1，加入已包被的平板中。

26.37°C 孵 育 2 h 后 ，棄去載體上清，用 PB S 清洗培養板。

2 7 . 以 I X l O 5 個/孔的密度， 〇.2m l 生長培養基將預刺激的 CD34+細胞加人孔中， 37°C孵育。

28?過夜培養后，將細胞離心，以 Im l 培養基重懸，并轉移細胞至 2 4 孔板，孵箱孵育。

2 9 . 轉 染 6 d 后， FA CS 分析轉染效率。