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| 實驗方法原理 |
病毒包裝的原理 質粒DNA為能轉錄出慢病毒遺傳物質（RNA），但不能翻譯出慢病毒的外殼及蛋白成分的載體質粒，其同時連有目的基因和報告基因，psPAX2為能表達慢病毒外殼的質粒，其表達產物可通過粘附機制更易穿過細胞膜， pMD2.G為慢病毒的膜蛋白質粒，通過 lipofectamine2000進行三質粒共轉到靶細胞基因組中，宿主基因組在表達時，隨宿主基因轉錄出的目的基因RNA與psPAX2、pMD2.G基因翻譯出的蛋白組裝為慢病毒。 在上述程序中提及的“第四天”收集病毒。在第五天再用該病毒感染靶細胞，病毒進入細胞后，其遺傳物質RNA反轉錄出DNA，該基因再整合到靶細胞的基因組中，完成轉染過程，因為質粒DNA只能轉錄出病毒RNA和表達目的基因卻不能表達出病毒的外殼和膜蛋白成分，因此其不能像普通的病毒一樣在宿主細胞能反復增殖，故對宿主細胞是無害的并且高效的將目的基因轉然到靶細胞基因組中。 |
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| 實驗材料 | |
| 試劑、試劑盒 | |
| 儀器、耗材 | |
| 實驗步驟 |
一、構建目的基因到載體 構建手段，一般是根據原始質粒信息確定克隆方案，有以下兩種手段。 （1）如果原始質粒與載體有匹配酶切位點，采用相應的內切酶切下相應片段，回收并連接到載體，酶切，并測序鑒定 （2）如果沒有匹配的酶切位點，則設計帶有特殊接頭的引物進行PCR擴增，得到目的片段，采用相應的內切酶切下相應片段，回收并連接到穿梭載體，酶切，并測序鑒定 二、質粒DNA在大腸桿菌里轉化 連接上目的基因的質粒轉化大腸桿菌是為了讓目的基因在大腸桿菌里擴增，然后提取質粒，以下是質粒DNA在大腸桿菌里轉化的三步驟。 1.大腸桿菌感受態細胞的制備 （1）從大腸桿菌平板上挑取一個單菌落于3mlLB培養基的試管中，37℃振蕩培養過夜。 （2）取0.4ml菌液轉接到40mlLB液體培養基中，37℃振蕩培養2~3h （3）菌液轉移到50ml離心管中，冰上放置10min （4）4℃離心10min（4000r/min） （5）倒出培養液，將管口倒置以便培養液流盡 （6）用冰浴的0.1mol/L氯化鈣10ml懸浮細胞沉淀，立即冰浴30min （7）4℃離心10min（4000r/min） （8）倒出上清液，用冰浴的0.1mol/L氯化鈣2ml懸浮細胞（冰上放置） （9）分裝細胞，200ul一份，4℃保存 2. 質粒DNA的轉化 （1）取200ul新鮮制備的感受態細胞，加入質粒DNA2ul混勻，冰浴30min （2）離心管放到42℃保溫90s （3）冰浴2min （4）每管加800ulLB液體培養基，37℃培養1h（150r/min） （5）取適當體積（100ul）的復蘇細胞，涂布在選擇性培養基上，正置30min （6）倒置平皿37℃，12~16h，出現菌落 3.質粒提取步驟 （1）取1~4ml在LB培養基中培養過夜的菌液，12000轉離心1min，棄上清 （2）加250ul溶液Ⅰ/RNaseA（溶液Ⅰ為細胞懸浮液）混合液，漩渦劇烈振蕩直至菌體完全重新懸浮，室溫靜置1-2min。 （3）加入250ul溶液Ⅱ（細胞裂解液），輕柔的反復顛倒混勻5-6次。室溫放置1-2min，使菌體充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。 （4）加入350ul溶液Ⅲ（中和液），立刻輕柔地反復顛倒混勻5-6次，此時會出現白色絮狀沉淀。 （5）12000室溫離心10min，收集上清。 （6）將上清置于DNA純化柱中，靜置1-2min。 （7）12000轉離心1min，棄濾液。 （8）加入500ul溶液PB（洗滌液）12000轉離心1min，棄濾液，目的是將硅膠膜上吸附的蛋白、鹽等雜質洗脫，以獲得高質量質粒DNA。 （9）加入500ul溶液W（去鹽液），12000轉離心1min，棄濾液，重復一次。 （10）12000轉離心3min，以徹底去除純化柱中殘留的液體。 （11）將DNA純化柱置于新的離心管中，懸浮滴加50-100ul溶液Eluent（為無菌的雙蒸水，PH為8.0-8.5），室溫放置2min。 （12）12000轉離心1min，此時管底即為高純度的質粒DNA，質粒于-20℃保存。 三、質粒DNA和其他包裝質粒共轉染293T細胞產生病毒（即病毒包裝） 共轉染的操作步驟 第一天：用無抗生素DMEM+10%FBS鋪板293FT細胞，2ml/孔。確保第二天細胞密度達到80%-90%融合度 第二天： （1）500ul 無血清培養基稀釋2ug 表達質粒+1.5ug psPAX2+1.5ug pMD2.G （2） 500ul 無血清培養基稀釋15ul 脂質體2000 （3）5min后，將DNA溶液和脂質體溶液混合，室溫靜止20min （4）從6孔板中吸出1ml無血清培養基，然后滴加入1ml質粒和脂質體混合物。 （5） 6-10h后，移除含有DNA-脂質體復合物的培養基，代之以正常培養液DMED+10%FB（從此刻開始算時間）。 第三天： 轉染24h后，熒光顯微鏡下觀察，轉染效率應達到70%以上 第四天： （1）轉染后48和72h分別收獲含病毒的上清。 （2）3000 rpm 離心20min，0.45um濾膜過濾，去除細胞沉淀。 （3）12000轉離心濃縮細胞、分裝-80°C貯存。 （4）滴度測定目的基因檢定，并出具檢測報告。 五、慢病毒感染細胞 1、流程圖  2、感染步驟 （1）鋪板：將對數生長期的細胞消化重懸后，按1*105/L密度接種于12孔板，生長過夜 （2）感染：將70-80%鋪滿12孔板中的培養液吸除，換新鮮的培養液，同時加入PBS濃度梯度稀釋的病毒液，混合均勻后即可放入孵箱培養。 （3) 24h左右可換液，48小時即可看熒光，具體根據細胞狀態來看。 3、熒光顯微鏡的操作流程 打開熒光器（30min內不能關閉，否則影響顯微鏡壽命），細胞培養板置于載物臺，調節物鏡和光圈，先用自然光觀察視野內細胞，再關閉光，開啟熒光通道，觀察熒光強度，判定感染率。圖片取樣前可以調節曝光時間，增益值和彩色度使熒光照片最完美。（針對leica） 六、感染后的細胞檢測方法 1.熒光初步檢測 若有熒光，則表示病毒感染成功，但并不能確定目的基因是否整合到細胞中，待進一步檢測，熒光有強弱之分，與病毒加入的量有關。 2.RNA的提取及RT-PCR檢測 （1）RNA提取步驟 加1mlTrizol，吹打后移至1.5ml無菌的離心管中；加100ul氯仿劇烈振蕩30s混勻，12000轉15min，可看到明顯分層；取上層透明液體至新的1.5ml離心管中，加等體積的異丙醇，混勻靜置10min，12000轉離心10min，棄上清，加1ml70%乙醇，12000轉，離心10min，棄上清，風干剩余液體，最后加DEPC-水溶解RNA，電泳，粗步判定RNA純度。 （2）RT-PCR步驟： RT是一個逆轉錄的過程，用前一天提取好的總RNA，在加入引物，模版和酶，并在PCR儀的溫度設置下，RNA可逆轉錄為cDNA。 PCR是cDNA在模版，引物，酶的作用下進行復制成雙鏈DNA。（具體步驟省略） 3.蛋白提取及Western檢測 western-Bloting：蛋白免疫印跡（Western blotting? 或 Immunoblotting）一般由凝膠電泳、樣品的印跡和免疫學檢測三個部分組成。第一步是做 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，使待測樣品中的蛋白質按分子量大小在凝膠中分成帶。 第二步把凝膠中已分成條帶的蛋白質轉移到一種固相支持物上， 用得最多的材料是硝酸纖維素膜(NC 膜)和 PVDF 膜， 蛋白轉移的方法多用電泳轉移 （轉移電泳） ，它又有半干法和濕法之分，現在大多用濕法。第三步是用特異性的抗體檢測出已經印跡在膜上的所要研究的相應抗原。免疫檢測的方法可以是直接的和間接的?，F在多用間接免疫酶標的方法，在用特異性的第一抗體雜交結合后，再用酶標的第二抗體（堿性磷酸酶（AP）或辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗第一抗體的抗體）雜交結合，再加酶的底物顯色或者通過膜上的顏色或 X 光底片上暴光的條帶來顯示抗原的存在。該技術被廣泛應用于蛋白表達水平的檢測中。 |
| 注意事項 |
2.感染病毒時培養基量少，以保證病毒的濃度，在培養10h左右可根據培養基顏色加培養基。 3.在不明確細胞感染復數情況下，可進行濃度梯度感染，計算細胞感染復數。 4.在加病毒后一般24h左右可換液，48小時即可看熒光，具體時間根據細胞狀態來看。 |
| 其他 |
名詞解釋 293T細胞是由293細胞派生, 表達SV40大T抗原的人腎上皮細胞系,? 被廣泛應用于瞬時轉染以過表達各種目標蛋白, 或是用以包裝病毒。 脂質體：某些細胞質中的天然脂質小體，可作為生物膜，用于捕獲外源性物質后更有效地運送到靶細胞，經同細胞融合而釋放。 |
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