一、材料準備
1. ?儀器：凈化工作臺、?離心機、恒溫水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差顯微鏡、培養箱、液氮冰箱。 ? 2. ?玻璃器皿：吸管（彎頭、直頭）、?培養瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、廢液缸。 ? 3. ?塑料器皿：?吸頭、槍頭、膠塞、移液管（10ml）、15ml離心管、凍存管（1～2ml）。 ? 4. ?其他物品：微量加樣槍、紅血球計數板、記號筆、醫用橡皮膏、移液槍。 ? 5. ?試劑：D-Hanks液、小牛血清、培養液、雙抗（青霉素、鏈霉素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO（分析純）或無色新鮮甘油。
二、細胞凍存 ? 1. ?配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養液。 ? 2. ?取對數生長期的細胞，用胰蛋白酶把單層生長的細胞消化下來，懸浮生長的細胞則直接將細胞移至15ml離心管中。 ? 3. ?離心1 000 rpm，5 min。 ? 4. ?去除胰蛋白酶及舊的培養液，加入適量配制好的凍存培養液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數，調節凍存液中細胞的最終密度為5×106/ml～1×107/ml。 ? 5. ?將細胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml。 ? 6. ?在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者。 ? 7. ?凍存：標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/ min；當溫度達-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2 h ，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內。 ? 三、 細胞復蘇 ? 1. ?從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時搖動令其盡快融化。 ? 2. ?從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養液，混勻。 ? 3. ?離心， 1 000 rpm，5 min。 ? 4. ?棄去上清液，加入含10%小牛血清培養液重懸細胞，計數，調整細胞密度，接種培養瓶，37℃培養箱靜置培養。 ? 5. ?次日更換一次培養液，繼續培養。 |
